多肽合成的常见问题

问：多肽的两端应如何处理？是保持自由状态还是屏蔽起来？ 
答：多肽是用来模拟蛋白的，为了模仿蛋白的表现，我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后，两端的电荷数将与***体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。 总体而言： 如果是出自蛋白C端的序列，通过乙酰化将N端屏蔽； 如果是出自蛋白N端的序列，通过酰胺化将C端屏蔽； 如果是出自蛋白中间部分，用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。 
问：如果我的肽纯度是95%，那么，其余的5%都是些什么物质？ 
答：多肽的纯度通常是通过HPLC，用每分钟1%的标准乙晴梯度来检测决定的。合成过程中，氨基酸之间的交联效率不是总能达到100%，因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了，但有少数的杂质其色谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样品中就构成了余下的几个百分点。
问：如何重新溶解多肽？ 
答：多肽的溶解与多肽的序列相关，首先试蒸馏水和超声（1-10MG/ML），如果不溶，计算肽中的碱性残基（Lys,Arg,His和自由氨基端）和酸性残基（Gly,Asp和自由羧基端）的数目。如果碱性基团偏多，可以滴加1N的醋酸，直到溶解为止，如果酸性基团居多，滴加1N的氨水，直到溶解为止。如果在实验中需要用缓冲液，建议在多肽完全溶解之前不要加入盐，因为盐会使肽的溶解度降低。如果上述溶液中肽都不溶，可以试试用少量***如DMSO，乙晴或***。
问：什么是多肽的净含量，它的意义是什么？ 
答：干品多肽的重量中不仅仅包含多肽，还包含有一些非肽的组份，如水，被吸收的溶剂、配位离子和盐等。肽的净含量是指肽在其中的重量百分比，这个百分比的数值范围很大，可能从50%到90%，取决于纯度、序列以及合成和纯化的方法，不要将肽的净含量和肽的纯度混为一谈，它们是完全不同的两个概念。纯度通常是由HPLC决定的。纯度定义的是多肽样品中含正确序列的组分的百分比，而肽的净含量是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比，肽的净含量通常是用氨基酸组分分析或紫外分光法测定的。这个信息主要是在一些对肽的浓度很敏感的实验中，对计算肽的浓度是很重要的。
问：对不同的实验，如何选择肽的纯度？ 
答：肽的纯度是很重要的指标，纯度的选择取决于实验的目的。对不太灵敏的筛选实验，建议使用粗品或>75%，对***级别，建议选用>85%。对于受体与LIGAND相互作用的研究，生物ASSAY研究，或细胞水平的研究，建议>95%，对于结构研究，建议>98%。  
问：如何保存多肽？ 
答：在可能的情况下，应该尽量将多肽以冻干粉的形式在-20℃下保存，这样会在几年内避免***的降解，二级结构的形成、氧化或其他修饰的发生。多肽在溶液中的稳定性要差一些，所以强烈建议使用灭菌水或灭菌过滤的方式进行溶解，如果序列中有Cys,Met或Trp等残基，用无氧的溶剂进行溶解以避免氧化。使用冷冻的溶液时，建议将溶液进行分装，以避免多次的溶解和冷冻对多肽造成的损害。pH的推荐范围是3-6之间。使用前应保证包装容器和所装物品回温到室温，以避免吸水。多肽溶液***好即配即用，使用过程中将肽溶液保持在低温但不结冻的状态下。长期保存（3个月到5年）：冻干粉，在-20℃下冷冻干燥保存；中期保存（0-3个月）：-20℃冷冻液体或冻干粉冷藏；短期保存（<1周）：冷藏的液体或冻干粉。  
问：常见的是用什么方法生产多肽？ 
答：线性多肽肽链的延伸采用Fmoc固相合成法，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将***个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢***将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接了上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接完毕后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。